2023-07-17
关键词：DNA提取, 分子生物学实验, 基因, 核酸理化性质、仪器选择, 实验步骤, 试剂推荐
前言
20世纪50年代以后，随着分子遗传学的发展，尤其是沃森和克里克提出DNA的双螺旋结构以后，人们才真正认识了基因的本质，即基因是具有遗传效应的DNA片段。
随着“人类基因组计划”测序的完成，人们不再满足于对基因结构的认知，逐渐转向对功能基因组学、蛋白质组学的研究上，DNA作为遗传的基本单位发挥着重要作用。
基于不同的研究目的，大部分的分子实验都需要制备高质量的DNA,用于各种各样的后续实验。例如，通过PCR获得目的基因、酶切、克隆、连接、转化、转染、研究DNA和蛋白的相互作用等。因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要，也是最基本的操作。
在应用上，提取的DNA可用千基因组作图、进化分析、模式生物体的基因敲除、转基因的研究。在分子医学领域，制备DNA的基因检测可用千法医鉴定、亲子鉴定、遗传病早期检测、感染疾病检测、肿瘤的诊断和预测、产前诊断和新生儿筛查等。
一、DNA提取需了解的三个知识点
1）DNA基础知识
细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物的DNA分为染色体DNA（双链线性）与细胞器DNA（双链环状）。
在原核生物中还有质粒DNA（双链环状）；在非细胞型病毒颗粒内，DNA存在的形式却多种多样。
2）提取DNA总则
保证核酸一级结构的完整性；
其他生物大分子的污染应降低到最低程度；
样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
应尽量去除其他核酸分子，如RNA。
3）核酸的理化性质
极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。
在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
二、血块中DNA提取的操作步骤
a) 取15ml的研磨器，加入血块样本后，再加入4-5ml的溶血试剂，研磨至血块消失后再研磨2-3min，然后移入到15ml离心管中；3000rpm，离心10min。
b) 离心结束后，弃去上层液后，加入8-10ml的溶血试剂，使用一次性滴管将沉淀吹打均匀；3000rpm，离心10min。
c) 待离心结束后，弃去上层液，再加入1ml溶血试剂，使用微呈移液器将沉淀吹打均匀，转移至2ml的EP管中；6000rpm，离心10min。
d) 弃去上清液，加入1ml细胞裂解液，将沉淀震荡均匀后，每个离心管加入10ul的蛋白酶k(20mg/ml)，37°C恒温水浴过夜，或者是56°C水浴3小时。
e) 水浴结束后，在通风橱内，每管加入1ml(等体积）平衡酚，上下颠倒混匀50次后，6000rpm，离心10min。离心结束后，吸取上清与另一个2mlEP管（水相含有DNA，白色絮状物为蛋白）。
f) 重复步骤5
g) 吸取上清与一个2mlEP管，然后加入等体积的氯仿／异戊醇(24:1)I上下颠倒混匀50次，6000rpm，离心10min。
h) 吸取上清液与另一个1.5mlEP管中，加入100ul3MNaAc（ph=5）轻轻混匀后，再加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，上下颠倒混匀150次，混匀时的动作要轻柔，混匀结束后可见白色的絮状物（即为DNA)，10000rpm，离心5min。
i) 弃去上清液，加入350-500ul无水乙醇，轻轻振洗，然后10000rpm，离心5min，(如在去除酒精的时候，DNA沉淀有悬浮，可以加大离心的转速），将酒精倒掉，把EP管放在通风橱中风干。（一般约两小时即可，如没有完全风干，可以适当的延长时间）。
j) 待DNA风干后，加入TE100ul，在4°C冰箱中存放约十天后，使用紫外分光计检测DNA的浓度和纯度，依据所测浓度稀释分装，分装完成后将三种液体置于-20"C的冰箱中保存备用。
三、所用器材
虹科高速离心机
虹科涡旋振荡器
烘箱
冰箱
虹科水浴锅
微量移液器10ul.100ul.1000ul.
虹科高压灭菌锅
离心管：15ml、2ml、1.5ml、1.0ml、0.5ml
一次性塑料滴管
15ml玻璃研磨器
四、所需试剂
溶血试剂，细胞裂解液，蛋白酶-K。
平衡酚，氯仿／异戊醇，醋酸钠，异丙醇，无水乙醇，TE缓冲液。
10%SDS、1M NaCI、0.5M EDTA、lM Trisbase-Hcl
十二浣基硫酸钠(SDS)
三经甲基氨基甲浣(Tris)
乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、MgCl2
曲拉通X-100:辛基苯基聚氧乙烯醚
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